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β-内酰胺类抗生素诱导革兰氏阴性菌开释内毒素对其疗效的影响
徐能武(解放军第97医院, 江苏南阳221004) 袁建成 肖光夏 郑江 秦孝建(沉庆市西南医院烧伤钻研所, 沉庆400038)
摘 要
探求β-内酰胺类抗生素在诱导革兰氏阴性菌开释内毒素(LPS)及对习染动物�；ばЯΨ矫娴牟罹�,旨在为临床上防治革兰氏阴性菌习染使佚确选择抗生素提供尝试凭据。
将Wistar大鼠背部做30%TBSA(Ⅲ°)烫伤,创面立即涂铜绿假单胞菌(PA103)悬液1ml(1× 109CFU),72h后造成大鼠烧伤创面脓毒症模型。烧伤脓毒症大鼠随机分为单纯抗生素医治组、半乳糖胺(GalN)敏化后医治组及爱兰苔胶(CGN)封关后医治组。别离用亚胺培南(IMP,5mg)和头孢他啶(CTZ,10mg)单剂量腹腔注射(i.p.)医治,对照组施以等量无菌生理盐水,同时,敏化组加用GalN 50mg i.p.,以增壮大鼠对LPS的敏感性,封关组在敏化组的基础上加用CGN 1mg i.p.,以阻断LPS的生物学效应。于抗生素医治前及医治后3、6及9h抽静脉血,检测血中细菌浓度,血浆LPS水平,并观察敏化组和封关组大鼠10d后的殒命率。了局IMP和CTZ均能使大鼠血中菌量显著降低;IMP和CTZ在杀菌过程中均能诱导PA103开释大量LPS,但CTZ组血浆LPS水平显著超过相应的IMP组(P <0.05或P <0.01);与此同时,敏化组大鼠的殒命率CTZ组显著高于IMP组(P <0.05),而在封关组,两者间的这种差距则隐没(P>0.05)。
了局批注,同属β-内酰胺类的IMP和CTZ在杀菌职能方面并无差距,但在诱导细菌开释LPS的能力方面CTZ> IMP;两者间的这种差距直接影响到各自对习染动物的�；ばЯ�,提醒在临床上防治革兰氏阴性菌习染时,选择诱导细菌开释较少LPS的抗生素(如IMP)可能更为合理。
关键词 β-内酰胺类抗生素; 革兰氏阴性细菌; 内毒素; 烧伤; 习染; j9游戏
只管广谱抗生素的利用,积极的液体复苏,实时的血管活性药物的支持和危沉症监护水平在不休提高,但革兰氏阴性细菌的习染依然是严沉烧、创伤病人重要殒命原因之一[1,2]。革兰氏阴性菌习染难治的重要原因是其开释的内毒素(LPS)启动机体不成逆转的炎症反映,促发脓毒症或脓毒性休克,最终导致病人产生多器官职能侵害或衰竭而殒命[2～ 4]。β-内酰胺类抗生素从来是防治革兰氏阴性菌习染的沉要伎俩,但国表近年来的钻研批注[1,5,7～ 10],抗生素是把“双刃剑” ,由于抗生素在杀灭细菌的同时又诱导革兰氏阴性菌开释大量的LPS,并且这种诱导开释的能力因抗生素的种类而异。由于LPS是烧伤脓毒症及脓毒性休克发病机造中的启动因子,更为沉要的是目前尚无一种确切有效而又可供临床利用的LPS拮抗剂,因而,各类抗生素诱导革兰氏阴性菌开释LPS能力的差距,必然最终影响其疗效的曲直。本尝试选择目前临床上防治革兰氏阴性菌习染最常用两种抗生素亚胺培南(imipenem,IMP)和头孢他啶(ceftazidime,CTZ),探求它们在医治大鼠烧伤创面脓毒症时的杀菌效力,诱导LPS开释,激活炎症介质产生,以及对习染动物�；ばЯΨ矫娴囊焱�,旨在为临床上防治革兰氏阴性菌习染时抗生素的选择提供尝试凭据。
1 资料和步骤
1.1 资料
1. 1.1 细菌 铜绿假单胞菌PA103(Pseudomonasaeruginosa,PA103)第全军医大学从属西南医院烧伤钻研所提供。
1.1.2 抗生素 亚胺培南(IMP),美国Merck Sharp& Dohme公司,批号V5134;头孢他啶(CTZ),英国Glaxo Wellcome公司,批号B4166GA。
1.1.3 动物 Wistar大鼠,体沉200± 20g,雌雄不限,第全军医大学表研所尝试动物中心提供。
1.1.4 试剂 鲎试仪专用j9游戏,乐山j9游戏厂,批号980225;j9游戏溶化水,乐山j9游戏厂,批号980125。 D-半乳糖胺(D-galactosamine,GalN)美国Sigma公司,批号117H3911。爱兰苔胶(carrageenan,CGN),美国Sigma公司,批号127H1222。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)及白介素6(interleu-kine-6,IL-6)放免药盒,北京东亚免疫技术钻研所提供。Griess试剂:第全军医大学从属西南医院烧伤钻研所提供。
1.1.5 仪器 紫表分光光度计 自动γ-计数仪:放射免疫γ-计数仪 内毒素自动分析仪 荧鲜明微镜: Olympus
1.2 步骤
1.2.1 去热原处置 三角锥瓶、玻璃试管、橡皮塞、吸头,EP管等洗濯干净后60℃烘干,各自分装后送钴-60照射彻底去热原。
1.2.2 PA103悬液造备 将PA103划线接种于血琼脂平板,37℃孵育24h,挑取单菌落转移到通常牛肉浸膏造就液中,置水浴恒温振荡器中37℃水浴振荡造就18～ 20h(频率60次/min)。造就液3000r/min离心15min,弃除上清,无菌生理盐水洗涤,再次离心弃除上清,沉复洗涤1次后用无菌生理盐水配成细菌浓度为1× 109CFU/ml的细菌悬液(光镜计数法),异硫氰荧光素象征后,置4℃冰箱备用。
1.2.3 大鼠烧伤创面脓毒症模型造作[11] 按文件[11]进行。
1.2.4 动物分组及处置
单纯抗生素医治组 将大鼠随机(随机表法)分为IMP医治组、CTZ医治组和对照组,每组大鼠24只�？股馗┕婊�: IMP 5mg /rat,CTZ 10mg /rat,烫伤及涂菌后72h腹腔注射,对照组注射等量无菌生理盐水。
半乳糖胺敏化及抗生素医治组 将大鼠随机分为IMP+ GalN组、CTZ+ GalN组和GalN+ saline组,每组大鼠10～ 12只�？股馗┕婊�,GalN50mg /rat,抗生素医治前1h腹腔注射。爱兰苔胶封关,半乳糖胺敏化及抗生素医治组 将大鼠随机分为IMP+ GalN+ CGN组、CTZ+ GalN+ CGN组和GalN+ CGN+ saline组,每组10～ 12只大鼠�？股匾街魏�GalN敏化同前,CGN 1mg /rat,抗生素医治前2d腹腔注射。
1.2.5 时相点设置和标本采集 共设置4个时相点,0h(抗生素医治前)和抗生素医治后3、6及9h,每个时相点6只大鼠。大鼠麻醉后剖腹,直视下腔静脉穿剌采血,取血浆置于去热原EP管中,-36℃贮存待测。
1.2.6 观察指标与检测步骤
细菌定量造就及菌种鉴定 取抗凝下腔静脉血100μl,无菌生理盐水10倍稀释后再取100μl于通常血琼脂平板,L棒均匀涂布,37℃孵箱造就24h行菌落计数,并用荧鲜明微镜检鉴定菌种是否为种植菌PA103。
LPS测定 选取动态浊度法[12],在BET-16细菌内毒素测定仪上进行。血浆TNF和IL-6测定 血浆标本在室温下解冻,测定用放免法,在自动γ计数仪上进行,操作按试剂盒说明书进行。
血浆NO测定 选取Griess法[13]。
殒命率观察 别离观察IMP+ GalN组,CTZ+GalN组,GalN+ saline组,IMP+ GalN+ CGN组,CTZ+ GalN+ CGN组,GalN+ CGN+ saline组大鼠的殒命率,观察期限为烫伤及涂菌后13d。
1.2.7 统计学处置 选取华西医科大学PEMS医学统计法式软件包进行统计学处置,数据以均数±尺度差(x±s)暗示,检验水准α定为0.05和0.01。
2 了局
2.1 抗生素医治后血中细菌菌量变动
烫伤及创面涂菌后3d,大鼠血中菌量达103～105CFU/ml。未用抗生素的对照组在各时相点菌量居高不下,而抗生素医治后各时相点血中菌量迅速削减,至用药后9h血造就已转阴,且IMP和CTZ杀菌效力类似,医治组各时相点血中细菌数量与对照组相比差距极度显著(P<0.01,Fig.1)。
2.2 血中内毒素水平变动
未医治组各时相点血浆LPS水平变动不显著;IMP医治后各时相点血浆LPS逐步升高,至9h达峰值,其中的3h及9h与医治前及未医治组同时相点相称比升高尤为显著;与上述分歧,CTZ医治后血浆LPS水平升高迅速而显著,各时相点与用药前及未医治组和IMP医治组同时相点相比差距显著或极度显著(P<0.05或P<0.01,Fig.2)。
2.3 血浆TNF的变动
未用抗生素医治组(saline组)血浆TNF水平呈缓慢降低趋向,但各时相点差距不显著(P> 0.05);IMP医治组各时相点血浆TNF变动不显著,与用药前比力无统计学差距(P>0.05);与上述分歧,CTZ医治组用药后各时相点血浆TNF水平升高,尤以3h最为显著,与医治前及对照组和IMP组同时相点相比差距显著(P<0.05,Fig.3)。
2.4 血浆IL-6水平变动
2.4.1 未用抗生素医治的对照组 血浆IL-6水平变动幼,各时相点间无统计学差距(Fig.4)。
2.4.2 抗生素医治组 IMP医治后血浆IL-6水平缓慢上升,至9h升幅最大,与医治前及对照组同时相点相迸仔显著差距(P <0.05),CTZ医治后血浆IL-6水平升高的速度快,幅度大,其6、9h两时相点与医治前及对照组和IMP组同时相点相比,均有极度显著的统计学差距(P<0.01,Fig.4)。
2.5 血浆NO变动2.5.1 未用抗生素医治的对照组 血浆NO水平在各时相点无显著变动(Fig.5)。
2.5.2 抗生素医治组 IMP医治后血浆NO水平呈逐步升高趋,9h升幅最大,3、6、9h 3个时相点与生理盐水对照组同时相点相比,均有显著或极度显著的统计学差距(P <0.05或P <0.01);CTZ医治后6h血浆NO水平起头升高,9h升幅最大,与医治前及生理盐水对照组和IMP组同时相点相比,升高更为显著,有极度显著的统计学差距(P<0.01,Fig.5)。
2.6 大鼠殒命率
2.6.1 敏化组大鼠殒命率 3组中CTZ+ GalN组殒命率最高,GalN+ saline组次之,IMP+ GalN组最低,两抗生素医治组之间的差距有显著统计学意思(P <0.05,Tab.1)。
2.6.2 封关组大鼠殒命率 经CGN封关单核-巨噬细胞系统后,各抗生素医治组殒命率降低,与对照组(GalN+ CGN+ saline组)相比,差距显著(P <0.05),而CTZ和IMP组之间原先的差距隐没(P> 0.05,Tab.2)。
2.7 有关分析
IMP医治的各组大鼠血中各类炎症介质水平与LPS水平呈显著正有关,CTZ医治组更是如此。有关分析了局见Tab.3。
3 会商
3.1 抗生素种类对诱导革兰氏阴性菌开释LPS的影响
近十年来国内表钻研发现,分歧种类的抗生素在诱导革兰氏阴性菌开释LPS能力上存在差距[1,3～ 5,7,8]。j9游戏钻研了局批注:同属β-内酰胺类的IMP和CTZ在医治铜绿假单胞菌PA103烧伤大鼠创面脓毒症时均能诱导细菌开释大量LPS,但无论开释的数量,还是开释的速度,CTZ都远超过IMP,两者差距极度显著(P<0.01,Fig.2)。提醒IMP可能在医治烧伤后革兰氏阴性菌习染时会诱导较少的内毒素开释,从而对预防或减轻致死性的内毒素血症有益。分歧抗生素在诱导革兰氏阴性菌开释LPS能力上的差距,与其对细菌胞壁上分歧青霉素结合蛋白(Penicillin Binding Proteins,PBPs)的亲和性有关。国表钻研已证实[1,10]:凡是与PBP3亲和性高的抗生素,可诱导细菌产生丝状扭转,开释较多的LPS,原因是此类抗生素可抑造细菌割裂,而细菌胞壁不休成长耽搁从而导致LPS不休开释。而与PBP2亲和性高的抗生素,诱导细菌产生球状变,由于球状体比一致质量的柱状体几何面积幼,加之球状体胞壁合成受抑,从而导致LPS合成和开释削减。 IMP属于PBP2高亲和性,CTZ属于PBP3高亲和性,这是两者在诱导革兰氏阴性菌开释LPS能力差距的底子原因。
3.2 血中LPS水平与炎症介质水平间的关系
国内表学者已公认: LPS是致死性炎症级联反映中的启动因子之一[2],抗生素对革兰氏阴性菌的急剧杀菌作用导致内毒素大量开释和产生TNF[6]。 TNF、IL-6和NO等则是介导脓毒症及脓毒性休克产生和发展的沉要介质[3],LPS开释、炎症介质产生、脓毒症及脓毒性休克产生和发展是三位一体的关系[14]。j9游戏钻研了局及有关分析批注:与IMP相比,CTZ医治大鼠烧伤创面脓毒症时,血中LPS、TNF及IL-6和NO水平较高(Fig.2～ 5),高水平的LPS与高水平的炎症介质之间关系亲昵(Tab.3),提醒在医治脓毒症及脓毒性休克时应尽量避用诱导革兰氏阴性菌开释较多LPS的抗生素(如CTZ)。
3.3 抗生素诱导革兰氏阴性菌LPS开释与抗生素疗效间的关系
为了进一步探求IMP和CTZ在诱导LPS开释及炎症介质产生方面差距的病理生理学意思,我们在尝试中设计了对烧伤脓毒症大鼠的敏化尝试和封关尝试。半乳糖胺(GalN)是一种可逆性肝细胞毒性物质,通过抑造肝细胞蛋白质合成来阻断肝脏的解毒职能,可显著提宏伟鼠对LPS的敏感性[13]。尝试了局批注:经GalN敏化的CTZ医治组大鼠的殒命率远高于敏化后IMP医治组的殒命率,两者差距极度显著(P <0.01,见Tab.1)。爱兰苔胶(CGN)是一种从海藻中提取的多糖类化合物,可选择性封关肝脏及腹腔单核-巨噬细胞系统对LPS的生物学效应,削减TNF及IL-6等炎性介质的产生。我们在尝试中发现,预吓酌CGN封关后,同样敏化的烧伤创面脓毒症大鼠殒命率显著降低,并且,IMP和CTZ医治组间的差距隐没(Tab.2),这进一步注明:只管IMP和CTZ杀菌职能一样,但由于各自诱导革兰氏阴性菌开释LPS及激活炎症介质产生的能力分歧,了局导致对习染动物的�；ばЯσ卜制�,提醒抗生素诱导革兰氏阴性菌开释LPS的能力对其疗效有直接影响。
简言之,凭据j9游戏钻研得出如下初步结论:
(1)同属β-内酰胺类的IMP和CTZ在对铜绿假单胞菌PA103杀菌效力方面并无显著差距;
(2)IMP和CTZ在杀菌的同时可诱导革兰氏阴性菌开释大量的LPS,开释能力CTZ>IMP;
(3)过量的LPS与高水平炎症介质(如TNF、IL-6及NO等)的产生关系亲昵;
(4)IMP和CTZ在诱导革兰氏阴性菌开释LPS方面的差距,直接影响到各自对习染动物的�；ばЯ�;
(5)由于上述原因,故在临床上医治革兰氏阴性菌习染所致的脓毒症或脓毒性休克时,选择诱导细菌开释较少LPS的抗生素(如IMP)可能更为合理。
参考文件（略）
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